Rote Fluoreszenz in zwei Schritten - Photonik

Ausgabe SH: BIOPHOTONIK 02/2017

Rote Fluoreszenz in zwei Schritten

Ein bei Proteinen vorkommender zweistufiger Farbwechselmechanismus ist die Grundlage für neue Anwendungen in der Mikroskopie und für funktionelle Analysen in der biologischen Forschung.

Bild: ETH Zürich
Bestrahlt man Dendra 2 (rechts dessen farbgebende chemische Verbindung) mit blauem Laserlicht, fluoresziert... mehr...

Mit Licht kann man die molekulare Struktur des grün fluoreszierenden Proteins Dendra 2 so verändern, dass es seine Farbe zu Rot wechselt. Forscher der ETH Zürich fanden einen zweiten Weg für diesen Farbwechsel: Man regt es zuerst kurz mit einem blauen Laserpuls an und bestrahlt es sofort danach mit Nah-Infrarot-Licht. Dieses zweistufige Farbumschalten kann unter anderem in der Fluoreszenzmikroskopie angewandt werden, um in einem Gewebe einen dreidimensional präzise definierten Punkt, beispielsweise eine einzige Zelle, sichtbar zu machen.

Ein internationales Forscherteam unter der Leitung von Prof. Periklis Pantazis vom Departement für Biosysteme der ETH Zürich in Basel hat diesen zweistufigen Farbwechselmechanismus nun aufgeklärt. Die Wissenschaftler nennen ihn „primed conversion“. Die neuen Erkenntnisse ermöglichen, andere Proteine, die auf Licht reagieren, so zu verändern, dass auch sie in zwei Stufen angeregt werden können. Die ursprüngliche Entdeckung machten die Wissenschaftler mit einem nicht-handelsüblichen Laser. Sie verwendeten dazu Licht im Nah-Infrarot-Bereich. Mittlerweile konnten sie aber zeigen, dass der Effekt auch mit handelsüblichen Rot-Lasern, wie sie in jedem Fluoreszenzmikroskop verbaut sind, eintritt.

Die Forscher untersuchten die mit blauem Licht aktivierten Proteine und konnten dabei zeigen, dass sich diese Proteine in einem angeregten Triplett-Zustand befinden, der mehrere Millisekunden anhält. Nach rund fünf Millisekunden fällt das Farbprotein Dendra 2 wieder in seinen Grundzustand zurück. Zur „primed conversion“ kommt es nur, wenn die zweite Stufe, die Bestrahlung mit Nah-Infrarot-Licht, innerhalb des Triplett-Zeitfensters erfolgt.

Die Lebensdauer des Triplett-Zustands hängt stark von der Stabilität des Farbproteins ab, und diese wiederum ist von der genauen Abfolge der der Aminosäuren abhängig. Die Wissenschaftler veränderten daher bei Dendra 2 die Aminosäure-Sequenz an mehreren Stellen. Dasselbe machten sie beim fluoreszierenden Protein Eos. Bei einigen der getesteten Proteinen verlängerte sich der Triplett-Zustand markant. Auch konnten die Wissenschaftler das Eos-Protein so verändern, dass es ebenfalls zweistufig aktivierbar wurde. Dasselbe gelang ihnen bei weiteren sechs, bisher nicht zweistufig aktivierbaren Proteinen.

„Primed conversion“ kann in der Mikroskopie verwendet werden, um in einem Gewebe einen eng umrissenenen Punkt zu markieren. Dazu lenken die Wissenschaftler einen blauen und einen roten Laserstrahl so in das Gewebe, dass sich die Strahlen an einem Punkt kreuzen. Nur in diesem Kreuzungspunkt kommt es zur „primed conversion“. Auch Anwendungen in weiteren Mikroskopietechniken seien denkbar, darunter in der extrem hochauflösenden Mikroskopie (super-resolution microscopy). Die ETH-Wissenschaftler arbeiten mit Proteinexperten zusammen, um weitere, in der Mikroskopie verwendete Farbproteine entsprechend zu verändern.

Originalveröffentlichung:

[M. A. Mohr, A. Y. Kobitski, L. R. Sabater, K. Nienhaus, C. J. Obara, J. Lippincott-Schwartz, G. U. Nienhaus, P. Pantazis, Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion, Angew. Chem. (2017), DOI: 10.1002/ange.201706121]

www.ethz.ch

 
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