Forschung & Entwicklung

Nanoclustern auf der Spur

Blinkende Fluorophore können leicht als Molekülcluster fehlinterpretiert werden. Eine neue nanoskopische Methode unterscheidet reale Cluster von Artefakten.

Lange Zeit hielt sich die Meinung, dass mit Licht keine Strukturen abgebildet werden können, die kleiner sind als die halbe Wellenlänge. Die Entwicklung der sogenannten Nanoskopie hat allerdings gezeigt, dass diese Regel gewisse Schlupflöcher offenlässt. Wenn man unterschiedliche Moleküle zu unterschiedlichen Zeitpunkten aufleuchten lässt, können sie am Ende zu einem scharfen Bild zusammenfügt werden. Inzwischen ist die Nanoskopie eine Methode, mit der unter anderem die Struktur der Zellmembran untersucht wird.

Dabei ist immer wieder zu beobachten, dass sich Membranproteine in Gruppen anscheinend zusammenballen. Auch an der TU Wien wurden diese Cluster untersucht und erkannt, dass es sich bei vermeintlichen Gruppen von Proteinen oftmals um einzelne blinkende Moleküle handelt, die mehrfach gezählt werden. Eine neue Methode, die das Team der TU Wien entwickelte, kann zwischen echten Clustern und solchen Artefakten unterscheiden.

Um die Nanoskopie auf biologische Proben anzuwenden, werden Proteine mit fluoreszierenden Molekülen (Fluorophore) markiert. In der klassischen Fluoreszenzmikroskopie ist ein einzelner Fluorophor nicht als klarer Punkt, sondern als leicht verschwommene Scheibe sichtbar. Leuchten alle Moleküle der Probe gleichzeitig, überlappen ihre Abbildungen und die Information über ihre räumliche Anordnung geht verloren. Über einen chemischen Trick können die Fluorophore allerdings zum Blinken gebracht werden. Man nimmt dann eine Serie von Bildern auf, wobei jeweils immer nur einige wenige Fluorophore aufleuchten. Am Computer wird die Position der Moleküle in jedem Einzelbild bestimmt und daraus schließlich ein hochaufgelöstes Bild der Probe rekonstruiert.

Vorherige Analysen der Anordnung von Proteinen auf der Zellmembran zeigen, dass sich fast alle untersuchten Proteine scheinbar nicht zufällig verteilen, sondern an bestimmten Stellen geballt als Cluster vorkommen. Das wirkte durchaus glaubwürdig. Man wusste bereits, dass T-Zellen bei der Antigen-Erkennung in kurzer Zeit stabile Proteincluster ausbilden können, die so groß sind, dass sie sogar mit klassischer Fluoreszenzmikrokopie nachzuweisen sind. Nanoskopisch kleine Proteincluster, so dachte man, könnten Vorläufer dieser größeren Strukturen sein – mit entscheidender Bedeutung für die Funktion von T-Zellen.

 „Wir haben überlegt, wie man Cluster abwechselnd leuchtender Moleküle von einem einzigen, immer wieder blinkenden Molekül unterscheiden kann“, berichtet Florian Baumgart von der Biophysik-Forschungsgruppe am Institut für Angewandte Physik der TU Wien. Gelungen ist das, indem die Konzentration der zur Markierung verwendeten Fluorophore schrittweise verändert wurde. In den aufgenommen Bildern können zufällig verteilte Moleküle mehrfach abgebildet werden, oder es kann sich tatsächlich um Clusterbildung handeln. Doch statistisch unterscheidet sich die Verteilung der Molekülpositionen in den beiden Fällen. Versammeln sich die Proteine tatsächlich in Clustern, dann werden dort zwar mehr Molekülpositionen sichtbar, aber dazwischen bleiben dunkle Freiräume. Handelt es sich allerdings um einzelne Moleküle, die mehrfach aufleuchten, dann wird bei steigender Konzentration fluoreszierender Moleküle die gesamte Fläche der Probe mit Molekülpositionen aufgefüllt ohne sich lokal massiv zu häufen.

„Auf diese Weise fanden wir, dass die untersuchten Membranproteine der T-Zellen vor deren Aktivierung gar keine Cluster bilden – diese Theorie muss verworfen werden“, erläutert Baumgart. Es gibt auch Beispiele für Proteine, die nachweislich molekulare Cluster ausbilden. Mit ihnen ergeben sich dann Bilder mit ganz anderen statistischen Eigenschaften als die zufällig verteilten T-Zell Proteine. Die Methode soll in Zukunft helfen, Bilder aus der Nanoskopie richtig zu deuten und die großen Rätsel der Zellmembran aufzuklären.

Originalveröffentlichung:

[F. Baumgart, A. M Arnold, K. Leskovar, K. Staszek, M. Fölser, J. Weghuber, H. Stockinger, G. J. Schütz, Varying label density allows artifact-free analysis of membrane-protein nanoclusters, Nature Methods, DOI: 10.1038/nmeth.3897]

www.tuwien.ac.at

© photonik.de 2020 - Alle Rechte vorbehalten