Forschung & Entwicklung

Auflösungsschub für Hochleistungslichtmikroskopie

Mithilfe verspiegelter Objektträger konnte die Bildauflösung eines Hochleistungslichtmikroskops signifikant erhöht und einzelne Molekülkomplexe aufgelöst werden, die sich mit einem normalen Lichtmikroskop nicht abbilden lassen.

Die Schärfe von Lichtmikroskopen ist aus physikalischen Gründen begrenzt: Strukturen, die näher beieinander liegen als 200 Nanometer verschwimmen ineinander – sie lassen sich nicht mehr voneinander unterscheiden. Ursache dieser Unschärfe ist die Beugung: Sie sorgt vereinfacht gesagt dafür, dass Lichtstrahlen sich nicht beliebig fein bündeln lassen. Jedes punktförmige Objekt wird daher nicht als Punkt, sondern als ‚Fleck‘ abgebildet.

Mit mathematischen Methoden lässt sich das Auflösungsvermögen dennoch deutlich verbessern. Dazu berechnet man aus der Helligkeitsverteilung des ‚Flecks‘ sein exaktes Zentrum. Das funktioniert aber nur, wenn zwei nahe benachbarte Punkte des Untersuchungsobjekts zunächst nicht gleichzeitig, sondern nacheinander sichtbar sind, und erst später in der Bildbearbeitung zusammengeführt werden. Durch diese zeitliche Entkopplung wird eine Überlagerung der ‚Flecken‘ verhindert. Forscher in den Lebenswissenschaften nutzen dieses Verfahren seit einigen Jahren zur superhochauflösenden Lichtmikroskopie von Zellen.

Eine Variante dieses Verfahrens, das an der Universität Würzburg in der Arbeitsgruppe von Professor Markus Sauer entwickelt wurde, ist die so genannte dSTORM-Methode. Hierfür werden bestimmte Strukturen – zum Beispiel eine Pore eines Zellkerns – mit fluoreszierenden Farbstoffen angefärbt. Jedes der Farbstoffmoleküle blinkt in unregelmäßigen Abständen auf und repräsentiert einen Teil der Pore. Das Bild der kompletten Kernporen ist also zunächst nicht sichtbar, sondern entsteht erst nach der Bildbearbeitung durch die Überlagerung mehrerer tausend Bilder.

Mit dem dSTORM-Verfahren lässt sich die Auflösung eines herkömmlichen Lichtmikroskops um den Faktor zehn steigern. „Dadurch ist zum Beispiel die Architektur einer Zelle bis auf Molekülniveau sichtbar“, erklärt Hannah Heil vom Rudolf-Virchow-Zentrum der Universität Würzburg. Sie konnte die Methode nun zusammen mit ihren Kollegen noch einmal entscheidend verbessern: Mithilfe eines einfachen Tricks ist es ihnen gelungen, die Auflösung nahezu zu verdoppeln.

Dazu bedampften sie ein Deckglas, auf dem die Zelle während der Beobachtung liegt, mit einer dünnen spiegelnden biokompatiblen Nanobeschichtung, die aus Silber und transparentem Siliziumnitrit bestand. Mit dieser Methode erzielten die Wissenschaftler zwei Effekte: Einerseits reflektierte der Spiegel das von der Pore ausgestrahlte Licht zurück zum Mikroskop, wodurch sich die Helligkeit des Fluoreszenzsignals erhöhte und somit ebenfalls die effektive Bildschärfe.

Dazu kommt ein zweites Phänomen: Die ausgestrahlten und die reflektierten Lichtwellen überlagern sich. Dadurch entstehen sogenannte Interferenzen. Dabei wird je nach Entfernung zum Spiegel das Licht verstärkt oder abgeschwächt. „Auf diese Weise sehen wir vor allem Strukturen in einer bestimmten Bildebene“, sagt Heil. „Alles was sich darüber oder darunter befindet und das Bild eventuell stören könnte, wird dagegen ausgeblendet.“ Damit genau die gewünschten Bildteile sichtbar werden, muss die Dicke der auf den Spiegel aufgebrachten transparenten Lage passend gewählt werden. Die Forscher nutzen unter anderem Computersimulationen, um die Beschichtung je nach Objekt maßzuschneidern.

Insgesamt sei die Methode erstaunlich leicht anzuwenden, betont Hannah Heil. Abgesehen von dem beschichteten Träger, dessen Herstellung kaum etwas kostet, benötigt man keine zusätzliche Mikroskopie-Hardware oder Software, um die Auflösung zu steigern. Das Verfahren ist also ein fantastisches Add-On für die moderne Mikroskopie.

von mn

Originalveröffentlichung:

[H. S. Heil, B. Schreiber, R. Götz, M. Emmerling, M.-C. Dabauvalle, G. Krohne, S. Hoefling, M. Kamp, M. Sauer, K. G. Heinze, Sharpening emitter localization in front of a tuned mirror, Light: Science and Applications 7 (2018), DOI: 10.1038/s41377-018-0104-z]

www.uni-wuerzburg.de/rvz

© photonik.de 2019 - Alle Rechte vorbehalten