Forschung & Entwicklung

10-fach schnellere Superauflösungsmikroskopie

Eine DNA-basierte Superauflösungsmethode ließ sich soweit beschleunigen, dass biomedizinische Hochdurchsatzstudien möglich werden. Nutzbar ist die Methode mit technisch vergleichsweise einfachen Mikroskopen.

Eine Variante der Superauflösungstechniken ist DNA-PAINT, die von Ralf Jungmann, Forschungsgruppenleiter für Molekulare Bildgebung und Bionanotechnologie am Max-Planck-Institut für Biochemie und Professor für Experimentalphysik an der LMU, und Kollegen entwickelt wurde. DNA-PAINT ermöglicht es, superaufgelöste Bilder mit technisch vergleichsweise einfachen Mikroskopen zu erhalten. Um das zur Rekonstruktion superaufgelöster Bilder notwendige Blinken von Zielmolekülen zu erreichen, werden diese bei DNA-PAINT mit kurzen DNA-Strängen markiert. In Lösung befindet sich ein komplementärer, farbstoffmarkierter DNA-Strang, der wiederholt an den Zielstrang an- und abbindet und das Ziel zum Blinken bringt. So erreicht DNA-PAINT sehr hohe Ortsauflösungen von besser als 10 nm und kann durch die Nutzung verschiedener DNA-Sequenzen viele Zielmoleküle gleichzeitig abbilden.

Die relativ langsame Bildaufnahme hinderte bisher DNA-PAINT, für biologisch relevante Hochdurchsatzstudien eingesetzt zu werden. Klassische Experimente mit dieser Technik nehmen üblicherweise mehrere zehn Minuten bis hin zu Stunden in Anspruch. Durch optimiertes DNA-Sequenzdesign und verbesserte Pufferbedingungen konnten die Wissenschaftler nun die Geschwindigkeit um einen Faktor 10 erhöhen. Hierzu haben die Forscher den Einfluss der DNA-Sequenz und der Basenabfolge auf die Geschwindigkeit der Hybridisierung, also das Ausbilden der Doppelhelix, untersucht. Der farbstoffmarkierte Einzelstrang, bei DNA-PAINT auch Imager genannt, besteht generell aus den Grundbausteinen der DNA, den vier Basen: Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C). Der Einfluss der Basenkomposition und Länge der Einzelstränge auf die Bindezeit ist recht gut verstanden: Je länger der Doppelstrang und je mehr GC-Basenpaare in der Sequenz vorhanden sind, desto stabiler ist der DNA-Duplex und desto länger die Bindezeit. Der Einfluss auf die Geschwindigkeit der Duplexbildung, und damit die Blinkgeschwindigkeit in DNA-PAINT, ist jedoch deutlich schlechter untersucht. Hier konnten die Forscher nun zeigen, dass die Ausbildung intramolekularer Haarnadelkonformationen, also das Falten mit sich selbst, in kurzen Strängen durch die Reduktion auf zwei Basen (z. B. nur T und C statt A, T, C, G) vollständig unterbunden werden kann.

Die Stränge wurden so entworfen, dass nur ein sogenanntes Zweibuchstabenalphabet, beispielsweise nur T und C oder nur A und G, benutzt wird. So konnte die Bindefrequenz bereits um einen Faktor 5 gesteigert werden. Durch weitere Optimierungen am verwendeten Puffersystem ließ sich zusätzlich ein Faktor 2 rausholen, sodass Bilder jetzt 10-mal schneller aufgenommen werden können, so die Wissenschaftler.

Von der DNA-Origami-Testplattform zur Zelle

Um die Verbesserungen der DNA-PAINT-Technik zu testen, kombinierten die Forscher diese mit DNA-Origami-Strukturen. Hierbei handelt es sich um selbstassemblierende DNA-Objekte in Nanometergröße, die sich autonom zu einer Art Steckplatte falten. Auf dieser befinden sich die Gegenstränge, die als definierte Punkte im Abstand von ungefähr 5 nm aufgetragen sind. Unter dem Mikroskop untersuchten die Forscher so die verbesserte Messgeschwindigkeit unter definierten Bedingungen. Im nächsten Schritt konnte die verbesserte Aufnahmegeschwindigkeit auch in zellulärer Umgebung gezeigt werden. Hierzu wurden in einer Zellprobe die Mikrotubli, ein Teil des Zytoskelettes, mit 10-fach höherer Geschwindigkeit sichtbar gemacht. Ein quadratmillimetergroßes Areal konnte so in acht Stunden bei einer Auflösung von 20 nm aufgenommen werden. Das hätte vorher fast vier Tage gedauert, so die Forscher.

von mg

Originalveröffentlichung:

[F. Schüder, J. Stein, F. Stehr, A. Auer, B. Sperl, M.T. Strauss, P. Schwille, R. Jungmann, An order of magnitude faster DNA-PAINT imaging by optimized sequence design and buffer conditions, Nat. Methods (2019), DOI: 10.1038/s41592-019-0584-7]

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